美国橡树岭国家实验室、美国田纳西大学、芬兰赫尔辛基大学农学院以及国家植物表型基础设施中心、芬兰自然资源研究所等单位的Kirk Overmyer教授研究团队，应用芬兰国家植物表型中心的PlantScreen高通量全自动植物表型系统，活体追踪测量拟南芥受灰霉病侵染的变化过程，创建了病菌侵染过程的量化追踪的可迁移开源模型，以及从种子萌发到数据分析的完整工作流程。研究成果于2021年1月发表在《Plants》杂志上。由于人们已经大量掌握拟南芥的基因工具，因此该侵染量化追踪模型能够很好的应用于其它植物与其它病原菌的相互作用研究中，用于筛选和培育抗病害作物种质等。

鉴定抗病作物或者易感作物种质，传统上多基于对症状颜色进行肉眼观察评估、对感染面积进行手工测量，但这种方法受人为因素影响而偏差很大；但是利用显微镜观察病原菌侵染情况并进行量化分析，则繁琐耗时、破坏样品、无法长期观察跟踪其发展过程，也无法实现海量样品筛查。

针对上述困难，数字化图像测量技术的优势是：无偏差、对海量样品可同时筛查、不损伤样品从而能够跟踪观察等。由于当今图像测量技术成本迅速降低、计算能力迅速增强，RGB图像和ChlF图像（叶绿素荧光成像）测量技术成为了植物病害研究以及抗病种质筛查研究的趋势：从颜色变化和植物光合生理变化两个方面、时间和空间两个维度，灵敏的追踪病害和植物的相互作用过程---例如本研究中的PlantScreen方案。

1. 样品感染工作流程

准备对照Col-0、易感cyp79 b2/b3（由于基因缺失而不能产生吲哚类抗毒素）、抗病lacs2-3样品，工作流程如下。

图 1. 本研究中拟南芥叶片感染工作流程： (A)种子种植、病原菌培养、接种、RGB成像测量和ChlF成像测量、图像在线存储及处理、数据分析。(B) 成像托盘中放置8个6孔板。(C) 接种后培养96小时的样品：对照Col-0、易感cyp79 b2/b3、抗病lacs2-3

2. RGB及ChlF（叶绿素荧光成像）图像数据处理流程

图 2. 2.   RGB及ChlF图像数据处理策略。RGB：将图像分为4类：背景、健康、萎黄、坏死，并分别用黄、红、绿、紫假彩色表示。ChlF：用Fo 图像作为Fv/Fm （评估光合能力）图像的蒙板来去除背景，并共同为每个像素划分阈值。

3.  ChlF图像计算方法

图 3. ChlF像素阈值划分评分策略：Col-0、cyp79 b2/b3、lacs2-3 三种样品。(A) Fv/Fm 假彩色图像。黄色代表健康区域，而蓝色和绿色代表症状区域。(B) 像素值的阈值分类。 (C) 症状像素数量。(D) 疾病严重程度

注：使用PlantScreen或者Fluorcam荧光成像测量功能，上图中所用到的原始数据都可以直接导出。

    ChlF可检测叶片光合生理的变化，因而更为敏感、提前。

4. RGB图像计算方法

图 4. RGB图像像素分类策略验证： (A) 上方为RGB图像，下方为每个像素的RGB代码计算得到的像素分类的图像； (B)健康、萎黄和坏死面积进展的堆叠色相图； (C) 健康、萎黄和坏死面积进展

注：上图中的原始数据，由PlantScreen的RGB功能得到并使用开源免费软件FIJI计算。PlantScreen的RGB模块同样具有颜色阈值分隔等数据计算功能。

参考文献：Mirko Pavicic，Kirk Overmyer Image-Based Methods to Score Fungal Pathogen Symptom Progression and Severity in Excised Arabidopsis Leaves，[J]，2021, 10, 158.

本研究使用芬兰国家植物表型基础设施中心的高通量植物表型测量系统完成：

该系统集成了Fyto Scope步入式生长箱、PlantScreenTM 紧凑式表型测量系统、12个LED光照培养架。系统可容纳54个托盘，每个托盘可容纳20个植株，同时对2592个叶片进行检测分析。植株在PlantScreenTM光隔离的光适应室、自动称重和浇灌室、RGB成像室、ChlF成像室之间自动传送和测量，进行光合特征、生长、形态变化的全生命周期追踪分析。

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